test
Кредит: CC0 Public Domain

Примерно через четыре месяца после первоначального описания случаев атипичной пневмонии в Ухане, Китай, в декабре 2019 года COVID-19 стал серьезной угрозой пандемии. К 12 апреля 2020 года около половины населения мира находилось в изоляции, при этом было зарегистрировано 1,8 миллиона официально диагностированных случаев. Ученые из Institut Pasteur, CNRS, Inserm и Université de Paris провели пилотное исследование для оценки надежности нескольких лабораторных тестов с целью лучшего понимания профиля реакции антител на SARS-CoV-2 и того, как вирус распространяется среди населения.

Были разработаны и оценены четыре теста на обнаружение антител к SARS-CoV-2, а также два теста на обнаружение нейтрализующих антител. Эти тесты, известные как лабораторные анализы, являются первым этапом эпидемиологических исследований COVID-19. Результаты этого исследования были опубликованы на сайте medRxiv 24 апреля 2020 г., а затем в Science Translational Medicine 17 августа 2020 г.

Оценка распространенности бессимптомных и симптоматических случаев заражения SARS-CoV-2 и их профиля реакции антител является жизненно важной частью усилий по сдерживанию вспышки и пролить свет на то, как распространяется вирус.

ПЦР-тесты в настоящее время широко используются во Франции и во всем мире, в том числе в Институте Пастера (Национальный справочный центр респираторных вирусов, далее именуемый CNR), для диагностики COVID-19, а также для выявления и количественной оценки SARS-CoV- 2 РНК. Эти вирусологические тесты необходимы для выявления и мониторинга людей с активной инфекцией.

Также используется ряд серологических тестов. Есть два типа:

  • Анализы обнаружения антител, которые показывают, выработал ли человек антитела против белков SARS-CoV-2 и, следовательно, ранее заразился этим вирусом.
  • Анализы нейтрализации, которые определяют, есть ли у человека нейтрализующие антитела и поэтому иммунизируется против вируса.

Важность надежных тестов

Надежность этих тестов имеет решающее значение. Поэтому несколько команд из Institut Pasteur, CNRS, Inserm и Université de Paris решили разработать серологические тесты, проведя пилотное исследование для оценки надежности четырех тестов обнаружения путем измерения уровней антител против SARS-CoV-2. Они также разработали два новых метода обнаружения, что дало им дополнительную точку сравнения. Группы образцов крови были взяты у разных категорий лиц. Эти группы, используемые для оценки анализов, можно разбить следующим образом:

  • образцы от 400 лиц до пандемии (2017–2019 гг.), использованные в качестве сравнительных образцов для определения специфичности анализов, гарантируя отсутствие или очень небольшое количество «ложноположительных результатов»;
  • образцы от 51 пациента с COVID-19 с тяжелыми или критическими формами из больницы Биша в Париже. Эти образцы определили чувствительность анализов и позволили ученым изучить кинетику ответа антител;
  • образцы от 209 человек с легкими симптомами (такими как лихорадка или кашель), взятые в департаменте Уаза 3 марта и 4 января 2020 г .;
  • образцы крови 200 бессимптомных доноров в Уазе, взятые в период с 20 по 24 марта 2020 г.

Результаты серопревалентности

Серопозитивность (наличие антител) была обнаружена у 32% людей с легкими признаками, совместимыми с COVID-19, за 15 дней до взятия образцов и у 3% бессимптомных доноров крови.

Время ответа антител

Ученые определили время ответа антител у госпитализированных лиц с COVID-19. Антитела появились через 5-6 дней после первых симптомов, с нейтрализующей активностью через 7-14 дней.

Эта временная шкала, вероятно, больше у лиц с легкими симптомами или бессимптомных лиц, а титры (концентрация) антител, вероятно, ниже.

Описание и оценка анализов

Исследовательские группы разработали четыре лабораторных теста для оценки уровня антител SARS-CoV-2 в сыворотке крови человека.

ELISA-анализы: два ELISA-анализа представляют собой обычные анализы, основанные на полноразмерном N-белке SARS-CoV-2 (ELISA N) или внеклеточном домене вирусного шипового белка (S).

Преимущества: эти анализы основаны на методе, который можно легко перенести, и он используется в коммерческих наборах. Анализ ELISA S был немного более чувствительным, чем анализ ELISA N.

Для обоих тестов был поднят вопрос о том, как их можно было бы использовать в больших масштабах или вывести на рынок, поскольку в настоящее время они являются собственными тестами. Анализы, основанные на аналогичном принципе, уже поступили в продажу и в настоящее время проходят оценку CNR.

Эффективность коммерческих анализов оценивается CNR с использованием образцов сыворотки, определенных как отрицательные или положительные на антитела против SARS-CoV-2 на основании как минимум двух серологических анализов, разработанных в Институте Пастера.

Анализ S-Flow: этот анализ определяет белок-спайк SARS-CoV-2 в его естественной конформации на поверхности клетки. Это очень чувствительно и специфично. Результаты были аналогичны ELISA S, с более высокой чувствительностью для низких уровней антител. Но для анализа требуется специальное оборудование (проточный цитометр), которое менее широко доступно, чем считыватели планшетов, обычно используемые в медицинских лабораториях. Это делает его более подходящим для использования в эпидемиологических исследованиях, а не в крупномасштабных диагностических исследованиях.

Анализ LIPS. В этом методе «иммунопреципитации» используется метод, отличный от других тестов, и он определяет связывание антител с белками SARS-CoV-2 N или S или их субдоменами. Тест обеспечивает подробное профилирование участков вирусного белка, на которые направлен ответ антител. Поэтому в анализе используются различные «целевые антигены», а чувствительность теста варьируется в зависимости от обнаруженного антигена. Для этого исследования использовались часть N и часть S (S1). Этот анализ также можно использовать в его нынешней форме для большинства животных.

Исследовательские группы также разработали два анализа для обнаружения нейтрализующих антител в образцах сыворотки инфицированных людей: один с использованием инфекционного вируса SARS-CoV-2 и требует доступа в лабораторию BSL3, а другой основан на «псевдовирусе», который может быть используется без необходимости в оборудовании BSL3.

Анализ нейтрализации инфекционного SARS-CoV-2 сложнее реализовать, поскольку с вирусом нужно обращаться в лаборатории BSL3. Он использует фиксированную дозу вируса, которая уничтожает 100% клеток. После смешивания его с различными разведениями сыворотки ученые наблюдают, достаточно ли присутствия антител против SARS-CoV-2 для нейтрализации вируса и подавления размножения вируса, тем самым предотвращая разрушение клеток.

Исследовательские группы также разработали тест нейтрализации, известный как Lenti S, на основе неинфекционного псевдовируса вместо вируса SARS-CoV-2. Этот анализ не требует помещения в лабораторию биобезопасности, что упрощает его реализацию в больших масштабах.

В отличие от тестов типа ELISA, которые выявляют антитела, анализ нейтрализации измеряет способность антител блокировать проникновение вируса в клетки. Таким образом, он может определить, есть ли у человека антитела, способные ограничивать размножение вируса и обеспечивать защиту от дальнейшей инфекции SARS-CoV-2. Исследовательские группы стремятся адаптировать этот анализ, чтобы его можно было использовать для высокопроизводительного тестирования. Потребуются дальнейшие исследования, чтобы определить количество нейтрализующих антител, которые могут обеспечить защиту, и их устойчивость с течением времени.

Корреляция между анализами

Чтобы оценить сравнительную надежность анализов, исследовательские группы сравнили их, используя три когорты.

У госпитализированных пациентов такое же количество положительных случаев было получено с помощью серологических анализов на основе N и S; Диагностическое применение этого теста для обнаружения антител против S1 было менее чувствительным, цель последнего заключалась в изучении корреляции с защитой.

В когорте пациентов с симптомами из Уаза тесты S-Flow и ELISA S и комбинация LIPS N + S1 дали очень похожие результаты и более высокие уровни обнаружения, чем с другими тестами. У доноров крови положительные случаи были обнаружены только с помощью тестов S-Flow и ELISA S.

В заключение:

1. Исследовательские группы сравнили эффективность четырех тестов на обнаружение антител к SARS-CoV-2. В целом они работали очень хорошо, с различиями в чувствительности в зависимости от теста и особенно от целевых антигенов.

2. Что касается анализов обнаружения нейтрализующих антител, то анализ нейтрализации псевдовирусов прост и надежен, но для него требуются помещения для культивирования клеток и специальное оборудование. Серологические анализы используются для оценки уровня связывания антител с вирусом, а не для определения их функциональности.

3. В настоящее время ученые устанавливают корреляции, чтобы оценить, какие образцы крови обладают нейтрализующей способностью, исходя из уровней связывания антител с различными частями вируса.

4. Присутствие нейтрализующих антител в крови может указывать на защиту от дальнейшей инфекции, особенно если титр высок, но это еще не было официально продемонстрировано.

5. Серологические тесты можно использовать в эпидемиологических исследованиях для определения распространенности серотипов среди определенных групп.

6. В группе первых случаев в Уазе наблюдалась значительная циркуляция вируса: у 32% людей с умеренными клиническими признаками, совместимыми с COVID-19, были антитела.

7. Результаты тестов, проведенных на бессимптомных лицах, зависели от исследуемых групп и их местонахождения. Например, из 200 тестов, проведенных у бессимптомных доноров крови в Уазе (люди, у которых недавно появились симптомы, не могут сдавать кровь), 3% были положительными.

«Эти анализы используются для выявления распространенности серы в эпидемиологических исследованиях, а также для диагностики отдельных лиц. Они также очень полезны для полной характеристики панелей сыворотки при оценке коммерческих тестов. В этом исследовании участвовали несколько групп из Института Пастера, работающих в сотрудничестве с врачами. и вирусологи из Парижской сети государственных больниц (AP-HP) и Inserm, эпидемиологи и Французская служба крови (EFS). Мы хотели бы думать о пациентах и ​​добровольцах, которые сдали кровь для этого исследования «, — подчеркивают соавторы исследования Марк Элоит, Хуго Муке, Оливье Шварц и Сильви ван дер Верф.

«Анализы ELISA N и ELISA S представляют особый интерес в текущих условиях. В Институте Пастера каждую неделю можно проводить тысячи тестов, а методика может использоваться в других лабораториях», — поясняет Сильви ван дер Верф. , Руководитель Национального справочного центра респираторных вирусов и последний автор исследования.

«Анализы типа LIPS имеют ту же чувствительность, что и анализы типа ELISA для того же антигена, и полезны для детального изучения вероятности защиты от дальнейшей инфекции в когортах из нескольких тысяч образцов сыворотки, чтобы определить, какие антигены оптимальны для -пропускное тестирование — подход, который будет иметь решающее значение для управления ослаблением мер изоляции. После этой работы мы также расширили использование анализа LIPS на обнаружение инфекции сезонными коронавирусами и их роль в защите или облегчении в отношении Инфекция SARS-CoV-2 «, — говорит Марк Элоит, руководитель лаборатории обнаружения патогенов и последний автор исследования.

«С начала исследования в марте 2020 года анализ S-Flow использовался для изучения степени гуморального ответа у пациентов с легкими симптомами ПЦР +. В настоящее время мы оцениваем продолжительность этого ответа. Мы анализируем образцы выздоравливающих людей, собранные в разные моменты времени после появления симптомов «, — говорит Оливье Шварц, руководитель отдела вирусов и иммунитета и последний автор исследования.




Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *