Редактирование РНК BFP, точечного мутанта GFP, с использованием искусственной дезаминазы APOBEC1 для восстановления генетического кода
Рисунок 1. Источник: Японский институт передовой науки и технологий.

Различные генетические заболевания, вызванные точечными мутациями, не имеют установленных терапевтических подходов. Профессор Цукахара и его коллеги (Японский передовой институт науки и технологий) изучают терапевтический метод с использованием искусственного редактирования РНК. Было объявлено, что в этом году Нобелевская премия по химии будет вручена двум ученым, открывшим CRISPR/Cas9 для редактирования генома.

Хотя редактирование генома привлекает внимание как технология восстановления генов, редактирование генома, такое как CRISPR/Cas9, может привести к необратимым изменениям в геномной ДНК, потенциально затрагивая несколько локусов. В настоящее время очень сложно выполнить точное редактирование генома всех клеток-мишеней in vivo. Таким образом, можно редактировать геном оплодотворенной яйцеклетки, эмбриона или клеток, однако это не подходит для генной терапии у людей. Более того, редактирование генома вызывает этические проблемы.

Таким образом, исследователи считают, что редактирование генома является подходящим методом для техник ex vivo или для использования в оплодотворенных яйцеклетках, но не во всем теле пациента. Напротив, изменения, возникающие в результате редактирования РНК, не являются постоянными, потому что они не влияют на последовательность генома, и могут быть выполнены в зависимости от последовательности. Поэтому для терапевтических целей редактирование РНК предпочтительнее редактирования генома, — говорит профессор Цукахара. Искусственное сайт-направленное редактирование РНК — важный метод модификации генов и, в конечном итоге, регулирования функции белков. Исследователи пытаются изменить генетический код транскриптов (РНК) путем искусственного редактирования РНК для лечения генетических нарушений.

Редактирование РНК — это физиологический процесс, широко распространенный в живых организмах, для производства различных белков с различными функциями из одного гена. У млекопитающих C или A цепи РНК подвергаются специфическому гидролитическому дезаминированию последовательности оснований, в результате чего C заменяется на U, а A на I (инозин). Эти превращения оснований происходят в результате дезаминирования A или C, которое, как было обнаружено, катализируется ферментами семейства ADAR и APOBEC, а затем изменяют генетические коды в РНК. В этой статье исследователи сообщают об успешном проведении искусственного преобразования C-to-U мутированной РНК с использованием APOBEC1 впервые.

Многие генетические заболевания вызваны точечными мутациями T-to-C. Следовательно, редактирование мутировавших генов представляет собой многообещающую стратегию лечения этих заболеваний. Исследователи создали искусственную РНК-редактазу, объединив деаминазный домен APOBEC1 (мРНК аполипопротеина B, редактирующий каталитический полипептид 1) с гидРНК (гРНК), которая комплементарна целевой матричной РНК (мРНК).

В этой искусственной ферментной системе гРНК связана со стержневой петлей MS2, а домен дезаминазы слит с белком оболочки MS2 и обладает способностью преобразовывать мутированные нуклеотиды-мишени из C в U. В качестве целевой РНК они использовали РНК, кодирующую синий флуоресцентный белок (BFP), который был получен из гена, кодирующего GFP, путем мутации 199T> C. После временной экспрессии обоих компонентов (дезаминазы и гРНК) они наблюдали GFP с помощью конфокальной микроскопии, указывая на то, что мутировавший 199C в BFP был преобразован в U, восстанавливая исходную последовательность GFP.

Этот результат был подтвержден с помощью ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция — полиморфизм длины фрагмента рестрикции) и секвенирования по Сэнгеру с использованием кДНК из трансфицированных клеток, что выявило эффективность редактирования примерно 21%. Результат глубокого секвенирования РНК показал, что нецелевое редактирование было достаточно низким в этой системе. Исследователи успешно разработали систему редактирования искусственной РНК с использованием искусственной дезаминазы (APOBEC1) в сочетании с системой MS2, которая может привести к лечению генетических заболеваний путем восстановления последовательностей дикого типа на уровне мРНК.




Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *